设为首页 加入收藏 联系我们
 
关闭
关闭
科学研究
美国加州大学伯克利分校研究出单细胞蛋白印迹方法
 单细胞蛋白印迹

摘要:
     为了探讨细胞间蛋白质介导的细胞功能差异,美国加州大学伯克利分校(UC Berkeley)生物工程系的研究人员开发出了一种可以在
4小时内同时电泳~103单细胞的蛋白质印迹scWesterns)。scWestern分析采用显微镜玻片,包被有30-μm厚的光敏聚丙烯酰胺(PA)凝胶:将单个细胞沉淀到微孔中,原位裂解,凝胶电泳,紫外线将蛋白质固定在凝胶上,抗体检测。研究人员应用这种scWestern方法来研究体外刺激下的大鼠神经干细胞信号和分化反应。scWesterns可以定量分析靶蛋白,可以检测分子量<30,000的单细胞的11个目标蛋白, 并且与流式细胞荧光分选技术结合应用时,scWestern可以用于低起始细胞数(~200)的分析。scWestern克服了其他单细胞蛋白质分析方法中抗体准确性和灵敏度的局限性,能够以单细胞分辨率研究复杂的细胞群体。

正文:
         异
质性是细胞过程所固有的,包括干细胞分化、发育、癌症、药效及免疫反应等。然而,最近的转录组学和蛋白质组学研究发现,微生物和哺乳动物的mRNA和蛋白质表达之间只有轻微的相关性。因此,为了充分了解复杂细胞群体中多样化的行为,研究人员需要一些分析工具,优化用于许多细胞的蛋白质分析,提供单细胞分辨率,提供靶蛋白的定量和高度特异性检测,并且不使用可能扰乱蛋白质和细胞功能的标记。目前的一些方法多存在限制:首先是,抗体的特异性有限。例如流式细胞术和免疫细胞化学,抗体探针的有限特异性可能会引起交叉反应产生错误的背景信号,从而限制了分析性能,即使仔细控制也难以纠正。其次,现在广泛使用的蛋白质印迹技术(western blot,主要反映的是细胞群体而非单细胞行为。现有印迹方法所需的细胞群平均值掩盖了复杂群体中发现的丰富的单细胞行为。

为此,美国加州大学伯克利分校(UC Berkeley)生物工程系的研究人员开发出一种单细胞western blotscWestern)方法。具体来说,它采用一块可扩展的开放式微孔芯片结构,能在4小时内同时分析~2000个细胞。他们应用这种方法来研究体外刺激下的干细胞信号和分化反应。                                                                   


                                                     

 
 为了实现数千个单细胞的同时分析,scWestern整合了所有关键的western blot步骤


    从设计原理上来说,首先scWestern实现了高度平行的分析,而不需要单独获取每个细胞。通过被动重力驱动的细胞设置,细胞悬液接种到微孔中,每个微孔在5-10分钟内捕获0-4个细胞。

其次,研究人员通过优化短分离距离的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),实现了高密度的scWestern芯片。在细胞裂解后电泳开始,他们在浸没的scWestern玻片上应用电场,电泳蛋白穿过微孔壁,进入薄的凝胶层。

再者,这一设备利用了反应(蛋白质固定)和运输(抗体杂交)的小特征长度。在PAGE之后,蛋白质与PA凝胶交联。之后进行抗体杂交和检测。

   scWesterns是一种单细胞蛋白质分析技术,能够进行定量、多重操作,促进了我们更好地理解细胞间蛋白质介导的细胞功能差异。scWesterns将蛋白质印迹的高特异性带入了单细胞分析,能够分析出干细胞信号传导通路中丰富的分级异质性。另外,通过测量分子量和抗体作为探针结合,我们能够识别同种蛋白的不同亚型。更广泛地说,scWesterns有希望应用在整合上游功能或形态筛选、量化细胞对药剂的反应及简化文库筛选。

原文检索

Single-cell western blotting

Nature Methods 11, 749–755 (2014) doi:10.1038/nmeth.2992


——肺血管组2018级刘诗韵

友情链接: 广州医科大学 广州呼吸疾病研究所 好大夫在线 365心血管网 广医附一 中华医学会 丁香园 广东省实验动物信息网